Факторы, влияющие на активность ферментов: температура, рН среды, действие ингибиторов

Биохимия человека / Факторы, влияющие на активность ферментов: температура, рН среды, действие ингибиторов

Страница 1

Ферменты, обладающие широкой специфичностью, (например, ЩФ) способны катализировать превращение довольно большого числа субстратов. Сродство фермента к субстратам различной природы, а также скорость их превращения могут значительно отличаться. Поэтому значения активности фермента, определённые при использовании разных субстратов, могут отличаться в несколько раз, и сравнивать их нельзя[10.89].

Степень очистки субстратов, используемых в диагностических наборах, как правило, должна быть не менее 98 %. Примеси, содержащиеся в препаратах субстратов, могут влиять на активность ферментов. Например, примеси в препаратах L- кетоглутарата значительно ингибируют активность АСТ и АЛТ. Кроме того, примеси могут снижать точность измерений. Так, примеси n-нитрофенола в препаратах п-нитрофенилфосфата увеличивают оптическую плотность холостой пробы, что приводит к снижению точности измерений.

Концентрация субстрата -- один из наиболее важных факторов, определяющих скорость ферментативной реакции. Концентрация субстрата, при которой достигается максимальная скорость реакции, называется насыщающей концентрацией. При снижении концентрации субстрата в реакционной смеси скорость реакции также снижается. Концентрации субстрата выше насыщающей могут привести к ингибированию фермента и снижению скорости ферментативной реакции.

Таким образом, определение активности ферментов нужно проводить при насыщающей концентрации субстрата.

В качестве буферных соединений в диагностических наборах используют растворы солей неорганических и органических кислот, амины (триоксиметиламинометан, диэтаноламин, триэтиламин, имидазол) и другие соединения. Природа буферного соединения влияет на скорость ферментативной реакции. Например, ион фосфата ингибирует активность ЩФ. Наибольшая скорость гидролиза субстратов ЩФ достигается в диэтаноламиновом буфере, более низкая -- в 2-амино-2-метил-1-пропаноловом буфере. Поскольку в наборах для определения ЩФ различные фирмы используют разные буферные растворы, сравнение результатов определения активности, полученных с помощью этих наборов, не всегда возможно.

Буферные соединения, используемые в наборах, должны иметь квалификацию “чда” или “хч”, т.к. примеси ионов металлов могут как ингибировать, так и активировать многие ферменты. Некоторые примеси, например продукты окисления или распада органических соединений, могут инактивировать фермент, ингибировать его активность, или вызвать окрашивание в холостой пробе.

Концентрация буферного соединения влияет на конформацию фермента в растворе и должна быть оптимальной для каждого фермента.

Ферменты чрезвычайно чувствительны к изменениям рН среды. Для каждого фермента существует оптимальное значение рН раствора, при котором превращение субстрата происходит с максимальной скоростью. Например, для ЩФ оптимум рН лежит в области 9,9-10,3, для АСТ и АЛТ -- в области 7,2-7,4 и т.д. Небольшие отклонения от оптимального значения рН могут вызвать уменьшение активности фермента в несколько раз.

В качестве активаторов ферментов в диагностических наборах используют ионы металлов (например, ионы магния для ЩФ) или органические соединения (например, пиридоксальфосфат в наборах для определения АСТ и АЛТ). В качестве стабилизаторов используют белки и их гидролизаты, полиэтиленгликоль, сахара, декстран и другие соединения. Как правило, в инструкциях по использованию наборов не указывают состав и количество добавленных стабилизаторов. Поэтому результаты определения активности ферментов наборами различных фирм, и тем более наборами, изготовленными в лаборатории, могут значительно отличаться.

Для большинства очищенных ферментов скорость ферментативной реакции пропорциональна концентрации фермента в реакционной смеси. Это справедливо, например, для реакций, катализируемых ЩФ. Некоторые ферменты (например, АСТ и АЛТ) не подчиняются этой закономерности. При уменьшении их концентрации в реакционной смеси скорость реакции не снижается пропорционально. Это связано со сложными структурными перестройками в молекулах ферментов при разбавлении.

В случае, когда активность ферментов определяют в сыворотке или других биологических жидкостях, где присутствует огромное количество различных соединений, зависимость активности фермента от его концентрации ещё более усложняется. Поэтому очень важно точно соблюдать дозировку сыворотки, указанную в инструкции, и отбор образца сыворотки проводить поверенной автоматической пипеткой.