Методика определения активности ЦП

Материалы / Антиоксидантная система плазмы крови в норме и при патологии / Материалы и методы / Методика определения активности ЦП

Определение церулоплазмина в плазме крови модифицированным методом Ревина [].

Принцип метода основан на окислении р-фенилендамина при участии церулоплазмина [Камышников, 2000].

Реактивы:

1. 0.5 %-ный водный раствор солянокислого р-фенилендиамина.

2. 0.4 М ацетатный буфер, рН 5.5. Готовят из двух растворов:

1) 54.44 г ацетата натрия растворяют в 1л дистиллированной воды;

2) 22.6 мл ледяной уксусной кислоты доводят до 1л.

Полученные растворы смешивали в отношении 9:1 в большом количестве.

3. 3%-ный раствор фтористого натрия. После растворения соли в дистиллированной воде раствор профильтровывают.

Ход определения:

В пробирки вносят по 8 мл ацетатного буфера и 0.1 мл плазмы. В контрольную пробирку добавляют 2мл раствора фтористого натрия (для инактивации ферментативной активности церулоплазмина). Затем во все пробирки вносят по 1 мл раствора р-фенилендиамина (используемого в качестве субстрата). Пробирки встряхивают, помещают в термостат и инкубируют в течение часа при температуре 37 ?С. После инкубации во все пробирки (за исключением контрольной) добавляют по 2 мл раствора фтористого натрия. Содержимое пробирок перемешивают, затем их переносят в холодильник, где выдерживают 30 мин при 4?С. Пробы колориметрируют против контроля (бледно-розовой окраски) в кюветах с шириной слоя 1,0 см при ? = 530 нм.

Умножая значение оптической плотности на коэффициент пересчета 875, получают величину концентрации церулоплазмина в мг/л.

Статистическая обработка результатов

Обработка эксперементальных данный проводилась общепринятыми методами [Лакин, 1980].